1.植物甾醇减少小鼠肝脏脂肪沉积，改善肝脏健康

   为了确定PS是否改善糖脂代谢，作者测定了小鼠血清中TG、TC、LDL-C和HDL-C的浓度，这些被认为是严重高脂血症(HLP)的临床生物标志物。HFD小鼠TG、TC、LDL-C浓度显著升高，HDL-C浓度降低。与预期一致，PS处理后TG、TC和LDL-C浓度显著降低，HDL-C浓度升高(图2(b)-2(e))。为了探究PS是否调节小鼠的糖耐量，我们在口服葡萄糖3 h的过程中，每隔30 min测量一次血糖浓度。血糖谱和OGTT曲线下面积(AUC)显示，HFD小鼠葡萄糖AUC增加，糖耐量受损，而HFD+PS小鼠的糖耐量较HFD小鼠明显改善(图2 (f)和2 (g)。

2.植物甾醇提高小鼠肝脏抗氧化活性

   作者检测了肝脏中氧化应激相关指标的mRNA水平。与ND小鼠相比，HFD显著降低血红素加氧酶1 (HO-1)的mRNA水平；与HFD组小鼠相比，PS显著提高了Kelch样ECH关联蛋白1 (Keap1)、核因子E2相关因子2 (Nrf2)、HO-1、NAD(P)H醌脱氢酶1 (NQO1)、谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰亚基(GCLM)和谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)的mRNA水平(图3 (a)~3 (f))。这些结果表明，PS不仅不会引起肝细胞损伤，而且显著提高了对HFD诱导的氧化应激的抵抗能力。

   这些结果表明，HFD显著增加了小鼠血清TG、TC和LDL-C的浓度，降低了HDL-C，导致HLP，并导致糖耐量受损。PS治疗逆转了这些变化，改善了HLP和葡萄糖耐量。

图2. PS提高了HFD小鼠肝脏抗氧化活性。(a~f)肝脏抗氧化基因Keap1、Nrf2、HO-1、NQO1、GCLM、GCLC的mRNA相对表达量(每组n = 3)。数据以均值±SD表示。与ND组相比，#P < 0.05，##P < 0.01和###P < 0.001；与HFD组相比，*P < 0.05，**P < 0.01和***P < 0.001。

3.植物甾醇调节胆固醇代谢相关酶和受体的mRNA表达

   为了探讨PS改善HLP的作用机制，作者首先检测了胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)、固醇12α羟化酶(CYP8B1)、氧固醇7α-羟化酶(CYP7B1)和甾醇27羟化酶(CYP27A1)以及与胆固醇代谢相关的胆汁酸(BA)合成限速酶的mRNA水平。结果显示，与ND小鼠相比，HFD小鼠CYP7A1和CYP8B1的表达明显升高，CYP27A1和CYP7B1的表达也呈增加趋势。PS干预导致HFD小鼠CYP8B1的mRNA相对表达量显著降低，CYP7A1呈下降趋势。在HFD+PS小鼠中，CYP7B1显著上调，CYP27A1有升高的趋势(图4 (a)-4 (d))。

   接下来，本研究还分析了肝脏中胆固醇代谢相关受体的mRNA相对表达量。结果显示，HFD引起小鼠成纤维细胞生长因子受体4 (FGFR4)、Takeda G蛋白偶联受体5 (TGR5)、法尼醇X受体(FXR) mRNA相对表达量升高，小异源二聚体蛋白(SHP) mRNA相对表达量降低。在HFD小鼠中，PS处理导致肝脏中TGR5和FGFR4的mRNA相对表达量显著降低，FXR和SHP的mRNA水平显著升高(图4(e)-4(h))。

   如上所述，PS抑制了肝脏胆固醇代谢的经典途径，促进了替代途径限速酶的表达。同时，PS抑制TGR5和FGFR4受体的表达，促进FXR和SHP受体的表达。

图3. PS调节胆固醇代谢相关酶和受体的mRNA表达。(a~d)肝脏中CYP7A1、CYP8B1、CYP27A1、CYP7B1等CYPs mRNA相对表达量。(e-h)肝脏中FGFR4、TGR5、SHP、FXR mRNA相对表达量。数据以均值±SD表示(每组n = 3)。与ND组相比，#P < 0.05，##P < 0.01和###P < 0.001；与HFD组相比，*P < 0.05，**P < 0.01。

4.植物甾醇缓解HLP的作用和肠道菌群变化相关

   相关研究表明，肠道菌群及其代谢产物与胆固醇代谢密切相关。为了验证PS的降血脂作用是否与肠道菌群有关，我们用Abx和FMT处理小鼠。结果显示，与HFD+non-Abx+PS小鼠相比，HFD+Abx+PS小鼠的TG、TC、LDL-C显著升高，HDL-C显著降低(图5 (a)-5 (d))。这意味着PS的降血脂作用被消除。此外，我们用PS处理FMT供体小鼠，并对Abx预处理的HFD小鼠给予FMT。与HFD+NS小鼠相比，HFD+FMT小鼠的TG、TC、LDL-C显著降低，HDL-C显著升高(图5 (e)-5 (h))，HLP明显改善。综上所述，PS缓解HLP的作用与肠道菌群密切相关。

5.植物甾醇改变小鼠肠道菌群结构

首先，肠道菌群的主成分分析(PCA)结果显示，ND组、HFD组和HFD+PS组的肠道微生物物种丰度存在不同的聚类(图6 (a))。此外，层次聚类分析显示PS处理改变了HFD小鼠的肠道菌群(图6 (b))。属水平的微生物群落组成分析显示，与HFD小鼠相比，HFD+PS小鼠Allobaculum的相对丰度降低(图6 (c))，乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)呈降低趋势(图6 (d)-6 (g))。值得注意的是，在种水平上，PS处理导致HFD小鼠阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginalis)显著减少(图6 (h))。Pearson相关系数表明，总体而言，这些产生胆盐水解酶(BSH-)的肠道微生物群的相对丰度与TG、TC、LDL-C和HDL-C的浓度以及细胞色素P450s (CYPs)的表达显著相关(图6 (i))。这些结果表明，PS的降血脂作用与改善小鼠肠道菌群结构有关。

图5. PS改变了小鼠肠道菌群结构。(a)主成分分析(PCA)图。(b)层次聚类分析。(c-g)肠道菌群在属水平上的相对丰度，包括Allobaculum、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus) (每组n = 4)。(h)阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginalis)的相对丰度。(i)肠道菌群与TC、TG、LDL-C、HDL-C、CYPs之间的Pearson相关系数。与ND组相比，#P < 0.05，##P < 0.01和###P < 0.001；与HFD组相比，*P < 0.05，**P < 0.01和***P < 0.001。

 脂类的直接摄入或者体内合成对动物健康影响深远，尤其脂肪肝已是部分动物的养殖后期死淘率的核心关键。植物甾醇因其在自然界中的广泛存在及其强大的性能而被广泛应用于医学研究。多项研究表明，PS显著降低血胆固醇浓度，在肥胖、HLP和糖尿病的治疗中具有重要的临床价值。

   在本研究中，PS治疗缓解了HFD小鼠的HLP，血清TG、TC和LDL-C水平显著降低，HDL-C水平显著升高。这些变化与已报道的PS降血脂作用一致。此外，我们还检测了PS对肝脏抗氧化功能的影响。在我们的实验中，PS提高了HFD小鼠Keap1、Nrf2、HO-1、NQO1、GCLM和GCLC的mRNA相对表达量。本研究表明，PS处理不仅没有引起HFD小鼠肝脏损伤，而且增强了肝脏的抗氧化作用，缓解了高脂对动物体的伤害。其机制与调节胆固醇代谢和肠道菌群结构有关。PS处理可调节肠道菌群的相对丰度，激活SHP和FXR，抑制FGFR4和TGR5，抑制BA合成的经典途径(CYP7A1和CYP8B1)，激活BA合成的替代途径(CYP27A1和CYP7B1)。本研究结果部分解释了PS治疗HLP的机制，可能与调节胆固醇代谢途径和肠道菌群结构有关。